Norma sanitară veterinara din 10 octombrie 2002

PREVEDERI GENERALE

Articolul 1

În sensul prezentei norme sanitare veterinare, se prevăd:

a)liniile directoare şi reglementările minime care se aplică planurilor de prelevare şi metodelor de diagnostic pentru detectarea şi confirmarea prezentei septicemiei hemoragice virale - SHV - şi necrozei hematopoetice infectioase - NHI;

b)integrarea dispoziţiilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 494/2001 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind condiţiile de sănătate a animalelor, care reglementează punerea pe piaţa a animalelor şi a produselor de acvacultura, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 191 din 21 martie 2002, cu privire la agrearea şi menţinerea agrearii zonei şi a unităţilor în zonele neagreate;

c)stabilirea dispoziţiilor care vizează diagnosticul corect al SHV şi NHI şi recunoaşterea oficială a statutului de zona agreată şi unitate agreată în zona neagreata, în conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 494/2001;

d)stabilirea conduitei autorităţilor responsabile cu controlul SHV şi NHI şi personalului de laborator care realizează testele pentru aceste boli. În consecinţa, accentul este pus pe procedurile de prelevare, principiile şi aplicatiile testelor de laborator şi evaluarea rezultatului acestora, precum şi pe tehnicile de laborator în detaliu. Totuşi, la nevoie, laboratoarele pot sa aducă modificări la testele descrise în aceasta anexa sau sa utilizeze teste diferite, cu condiţia să fie dovedite o sensibilitate şi o specificitate echivalente. Partea I cuprinde planurile de prelevare şi metodele de diagnostic pentru supravegherea SHV şi NHI cu scopul de a obţine menţinerea statusului de zona agreată sau unitate agreată în zona neagreata. Partea a II-a descrie procedeele de diagnostic pentru confirmarea SHV şi NHI în caz de suspiciune. Partea a III-a cuprinde criteriile şi liniile directoare aplicabile unui program de inspecţie sanitară veterinara oficială care să dovedească absenta anterioară a SHV şi/sau NHI. Partea a IV-a furnizează recomandări asupra procedurilor de titrare a virusurilor NHI şi SHV în scopul verificării sensibilităţii culturilor celulare la infectie. În partea a V-a sunt enumerate acronimele şi abrevierile.Partea I Planurile de prelevare şi metodele de diagnostic pentru supravegherea septicemiei hemoragice virale - SHV - şi necrozei hematopoetice infectioase - NHI - la peşti pentru obţinerea şi menţinerea agrearii unei zone sau unei unităţi dintr-o zona neagreata

Capitolul 1Inspecţii şi prelevare

Articolul 2

Dispoziţii generale relative la inspecţiile sanitare veterinare clinice, la colectarea şi selecţionarea probelor pentru supravegherea zonelor sau unităţilor situate în zone neagreate, în scopul obţinerii sau menţinerii agrearii pentru SHV şi/sau NHI

a)Inspecţiile sanitare veterinare clinice şi prelevarile de tesuturi de peste şi/sau lichid ovarian se efectuează în zone sau unităţi situate în zone neagreate, în vederea obţinerii sau menţinerii agrearii pentru SHV şi/sau NHI, în conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 494/2001. Alte detalii sunt prezentate în art. 3-5. Schemele de inspecţie şi recoltare prevăzute în anexele nr. 1 şi 2 nu se aplică unor unităţi noi sau unităţilor care acum încep activitatea cu peste, icre sau lapti care provin din zone agreate sau din unităţi agreate situate în zone neagreate, cu condiţia ca ele sa îndeplinească cerinţele prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 494/2001.

b)Inspecţiile clinice trebuie să fie efectuate în cursul perioadei cuprinse între lunile octombrie şi iunie sau când temperatura apei este inferioară celei de 14°C. Atunci când unităţile trebuie să facă obiectul unei inspecţii clinice de doua ori pe an, intervalele dintre inspecţii trebuie să fie de cel puţin 4 luni. Toate unităţile de producţie (bazine, cuve, viviere etc.) trebuie să fie supuse unei inspecţii destinate sa stabilească prezenta de peşti morţi, agonici sau cu comportament anormal. O atenţie particulară trebuie să fie acordată punctului de evacuare a apei, unde pestii agonici au tendinta să se acumuleze în curentul de apa.

c)Pestii care se preleveaza sunt selecţionaţi după cum urmează:

1.dacă sunt prezenţi pastravi curcubeu, singurii care se preleveaza sunt aceştia; dacă aceştia nu sunt prezenţi, prelevarea se compune din toate speciile prezente, în măsura în care aceste specii sunt sensibile la virusurile SHV şi/sau NHI şi în conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 494/2001; în proba speciile trebuie să fie reprezentate proporţional;

2.dacă mai mult de o sursa de apa este utilizata pentru producţia de peste, în proba prelevata trebuie să fie incluşi pestii care să reprezinte toate sursele de apa;

3.dacă sunt peşti în agonie, cu comportament anormal sau peşti morţi recent, dar nu descompusi, aceştia trebuie selecţionaţi în primul rând; dacă aceşti peşti nu sunt prezenţi, proba prelevata trebuie să fie compusa din peşti cu aspect anormal, aparent sanatosi, din toate zonele din unitate, astfel ca toate clasele de vârsta să fie reprezentate proporţional în proba.

Articolul 3

Dispoziţii specifice, incluzând colectarea probelor, relative la supravegherea zonelor sau unităţilor din zonele neagreate, în scopul obţinerii agrearii pentru SHV şi/sau NHI

a)O zona sau o exploatatie dintr-o zona neagreata, plasata sub controlul serviciilor sanitare veterinare, poate obţine agrearea pentru SHV şi/sau NHI cu condiţia să se supună unuia dintre următoarele doua programe:

1.Modelul A - Program de supraveghere pentru 2 ani. După cel puţin 2 ani de absenta a unui semn clinic de SHV şi/sau NHI, toate unităţile dintr-o zona sau orice unitate dintr-o zona neagreata destinată agrearii trebuie să facă obiectul unei inspecţii sanitare veterinare de doua ori pe an, timp de 2 ani. În timpul acestei perioade de control de 2 ani care precede obţinerea agrearii, absenta oricărui semn clinic de SHV şi/sau NHI trebuie să fie continua, iar prelevarile de probe să se efectueze în conformitate cu anexa nr. 1. În plus, probele trebuie să fie selecţionate, prelucrate şi examinate conform dispoziţiilor art. 2-5, iar examenele de laborator trebuie să fie negative pentru SHV şi/sau NHI;

sau

2.Modelul B - Program de supraveghere pentru 2 ani, cu o mărime redusă a probei prelevate. Ca urmare a unui program de inspecţii sanitare veterinare oficiale care poate dovedi absenta SHV şi/sau NHI pentru cel puţin 4 ani, toate unităţile din zona sau orice unitate dintr-o zona neagreata, destinată agrearii, trebuie să facă obiectul unei inspecţii sanitare veterinare de doua ori pe an, timp de 2 ani. În cursul acestei perioade care preceda obţinerea agrearii, absenta semnelor clinice sau a altor semne de SHV şi/sau NHI trebuie să fie continua, iar probele se preleveaza pentru examen în conformitate cu anexa nr. 2. În plus, prelevarile trebuie să fie selecţionate, pregătite şi examinate conform dispoziţiilor art. 2-5, iar examenele de laborator să fie negative pentru SHV şi/sau NHI.

Pentru ca un program de inspecţii sanitare veterinare să fie recunoscut de către serviciile sanitare oficiale ca făcând dovada absentei anterioare a SHV şi/sau NHI, trebuie să îndeplinească şi să respecte criteriile stabilite în partea a III-a.

b)Dispoziţii speciale sunt aplicabile în unităţile nou-agreate şi în unităţile care încep activitatea cu peşti, icre sau lapti provenind dintr-o zona agreată sau dintr-o unitate agreată dintr-o zona neagreata.

Unităţile noi sau unităţile care îşi încep activitatea cu peşti, icre sau lapti provenind dintr-o zona agreată sau unitate agreată din zona neagreata pot obţine agrearea în conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 494/2001. În consecinţa, dispoziţiile de prelevare sunt stabilite în conformitate cu modelele A şi B prevăzute la lit. a) de mai sus.

Articolul 4Program de supraveghere pentru menţinerea agrearii pentru SHV şi/sau NHI

În scopul menţinerii agrearii într-o zona sau într-o unitate dintr-o zona neagreata pentru SHV şi/sau NHI, inspecţiile şi prelevarea probelor pentru examen trebuie să se efectueze în conformitate cu anexa nr. 3. Probele trebuie să fie selecţionate, pregătite şi examinate în conformitate cu dispoziţiile art. 2-5, iar rezultatele examenelor de laborator să fie negative pentru SHV şi/sau NHI.

Articolul 5Pregătirea şi expedierea probelor de peste

a)Înainte de a fi expediate sau transferate către laborator, se preleveaza de la peşti organe sau fragmente de organe cu ajutorul instrumentelor de disectie şi se transfera în tub de plastic steril conţinând mediu de transport - mediu de culturi celulare cu 10% ser fetal bovin şi antibiotice. Se recomanda combinatia de 200 UI penicilina, 200 æg streptomicina şi 200 æg kanamicina/ml, dar în aceeaşi măsura pot fi utilizate şi alte antibiotice cu eficacitate demonstrata. Tesuturile pentru examinat sunt splina, rinichiul anterior şi, după caz, cordul sau encefalul. În anumite cazuri trebuie examinat lichidul ovarian, în conformitate cu anexele nr. 1-3. Lichidul ovarian sau fragmente de organe de la maximum 10 peşti - anexele nr. 1-3 - pot fi comasate într-un tub steril conţinând 4 ml mediu de transport şi care să reprezinte un esantion (pool) global. Tesuturile din fiecare pool trebuie să fie în cantitate de cel puţin 0,5 g. b) Tuburile cu probe se introduc într-un recipient izolat, de exemplu o cutie de polistiren cu pereţii grosi, cu o cantitate suficienta de gheaţa, care să garanteze refrigerarea probelor pe timpul transportului până la laborator. Trebuie evitata congelarea probelor. Temperatura probei pe timpul transportului nu trebuie să depăşească 10°C, recipientul de transport trebuie să mai conţină gheaţa când ajunge la destinaţie, iar blocul refrigerator trebuie să fie parţial sau total congelat.

c)Examenul virusologic trebuie să înceapă imediat sau cat mai curând posibil, cel târziu în 48 de ore de la prelevarea probelor. În cazuri excepţionale, de exemplu atunci când pestii provin din zone indepartate, fără posibilitate de expediere zilnica, examenul virusologic poate fi efectuat în 72 de ore de la colectarea materialului de examinat, cu condiţia ca acesta să fie protejat cu mediu de transport, iar condiţiile de temperatura pe timpul transportului să fie cele indicate mai sus. Se pot expedia şi peşti vii. Condiţiile de ambalare şi etichetare trebuie să respecte reglementările naţionale sau internaţionale în vigoare în materie de transport, dacă este cazul.

Articolul 6Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic

De comun acord cu Institutul de Diagnostic şi Sănătate Animala, şi alte probe pot fi colectate şi pregătite în vederea examenelor suplimentare.

Capitolul 2Prepararea probelor în vederea examenului virusologic

Articolul 7Congelarea în cazuri excepţionale

Dacă exista dificultăţi obiective, precum condiţii climaterice defavorabile, zile nelucrătoare, probleme de laborator, care împiedica inocularea celulelor în primele 48 de ore de la colectarea probelor de tesut, este admis ca probele să fie congelate în mediu de cultura la -20°C sau la o temperatura inferioară, iar examenul virusologic să se efectueze într-o perioadă de 14 zile. Totuşi proba nu poate fi congelata şi decongelata decât o singură dată înaintea examinării. Este necesar să se ţină un registru în care să fie menţionate cauzele fiecărei congelari a probelor de tesut, de exemplu furtuni, linii celulare moarte etc.

Articolul 8Omogenizarea organelor

În laborator, tesuturile trebuie să fie complet omogenizate cu ajutorul unui stomacher sau cu mojar şi nisip steril, după care produsul se introduce în mediul de transport original. Dacă proba este compusa din peşti întregi mai mici de 4 cm lungime, aceştia se fragmenteaza cu foarfecele steril după ce se elimina coada din spatele anusului. Dacă proba este constituită din peşti cu dimensiuni de 4-6 cm, se colectează viscerele şi rinichiul. Dacă pestii sunt mai mari de 6 cm, tesuturile se recolteaza conform prevederilor cap. I art. 4. Probele de tesut se reduc la fragmente mici cu ajutorul foarfecelui steril sau bisturiului, se omogenizeaza şi se introduc în mediul de transport, asa cum s-a menţionat mai sus. Raportul final între materialul tisular şi mediul de transport trebuie să fie de 1:10.

Articolul 9Centrifugarea omogenatului

a)Omogenatul este centrifugat în centrifuga cu răcire, la o temperatura cuprinsă între 2-5°C la 2.000-4.000 x g, timp de 15 minute, iar lichidul supernatant este colectat şi tratat, fie 4 ore la 15°C, fie peste noapte la 4°C, cu antibiotice; de exemplu, 1 mg gentamicina/ml poate fi foarte util în acest stadiu. Dacă proba a fost expediată în mediu de transport - adică sub antibiotic -, tratamentul lichidului supernatant nu mai este necesar. Tratamentul cu antibiotic vizează împiedicarea contaminarii bacteriene a probei şi face inutila filtrarea prin filtru cu membrana. Dacă lichidul supernatant colectat este congelat la -80°C în curs de 48 de ore de la prelevarea probei, acesta poate fi utilizat o singură dată pentru examen virusologic.

b)Dacă exista dificultăţi obiective - incubator defect, probleme cu mediile de cultura celulare - care împiedica inocularea celulelor în primele 48 de ore de la prelevarea probelor de tesut, este admis ca lichidul supernatant să fie congelat la -80°C, iar examenul virusologic să fie executat în maximum 14 zile. Înainte de a inocula celulele, se amesteca supernatantul cu părţi egale cu un pool de antiser contra serotipurilor indigene de virus al necrozei pancreatice infectioase - NPI -, diluat într-o maniera adecvată şi incubat timp de minimum o ora la 15°C sau maximum 18 ore la 4°C. Titrul antiserului trebuie să fie cel puţin 1/2.000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50% - reducerea plajelor. Tratamentul efectuat prin inocularea cu ser antivirus NPI la culturile celulare - virus care în anumite regiuni din Europa este prezent în 50% din probele de peste - vizează împiedicarea apariţiei unui efect citopatic dat de NPI în respectivele culturi celulare. Acest tratament permite reducerea duratei examenului virusologic, astfel ca numărul de cazuri în care apare efectul citopatic să fie considerat ca un indicator potenţial de SHV şi/sau NHI. Atunci când probele provin dintr-o unitate considerată indemna la NPI, tratamentul cu ser antivirus NPI poate fi omis.

Capitolul 3Examinarea virusologica

Articolul 10Culturile celulare şi mediile de cultura

a)Linii celulare Bluegill fry - BF2 - sau Rainbow trout gonad - RTG2 - şi Epithelioma papulosum cyprini - EPC - sau Fathead minnow - FHM - sunt crescute la temperaturi de 20-30°C în mediu corespunzător, de exemplu Eagle's MEM sau modificări ale acestuia, cu un supliment de ser fetal bovin de 10% şi antibiotice în concentratii standard.

b)Când celulele sunt cultivate în sisteme închise, este recomandat ca mediul să fie tamponat cu bicarbonat de sodiu. Mediul folosit pentru cultivarea celulelor în sisteme deschise poate fi tamponat cu Trishidroximetil aminometan - Tris-HCI, 23 mM şi bicarbonat de sodiu, 6 mM; pH-ul trebuie să fie 7,6 ± 0,2. c) Culturile celulare folosite pentru inocularea cu omogenat de tesuturi trebuie să fie ţinere, 4-48 de ore, şi în faza de creştere, neconfluente, la inoculare.

Articolul 11Inocularea culturilor celulare

a)Suspensia de organe tratata cu antibiotice este inoculata pe culturi celulare în doua dilutii, de exemplu dilutia primara şi în plus o dilutie de 1:10 din aceasta, rezultând dilutii finale ale omogenatului de organe în mediul de culturi celulare de 1:100 şi, respectiv, 1:1.000, în scopul prevenirii interferentei omologilor. Cel puţin doua linii celulare trebuie să fie inoculate în conformitate cu prevederile art. 10 lit. a). Raportul dintre volumul inoculului - suspensia de organe tratata cu antibiotice - şi volumul mediului de culturi celulare trebuie să fie de aproximativ 1:10. b) Pentru fiecare dilutie şi fiecare linie celulara trebuie să fie utilizata o suprafaţa de aproximativ 2 cmc, corespunzând unui godeu dintr-o placa cu 24 de godeuri. Folosirea plăcuţelor cu godeuri este recomandată, dar sunt acceptate, de asemenea, şi alte suporturi cu suprafaţa de creştere similară sau mai mare.

Articolul 12Incubarea culturilor celulare

a)Culturile celulare inoculate sunt incubate la temperatura de 15°C pentru 7-10 zile. Dacă culoarea mediului culturilor celulare virează de la roşu la galben, indicând o acidifiere a mediului, se va ajusta pH-ul mediului cu soluţie sterila de bicarbonat de sodiu sau substanţe echivalente, pentru a asigura susceptibilitatea culturii celulare la infectie.

b)La fiecare 6 luni sau dacă este suspectata scăderea susceptibilitatii celulare, se va efectua calcularea titrului stocurilor de virusuri inghetate pentru SHV şi NHI, pentru a verifica susceptibilitatea culturilor celulare la infectie. O procedura recomandată este prezentată în partea a IV-a.

Articolul 13Microscopia

Culturile celulare inoculate trebuie să fie inspectate zilnic sau cel puţin de trei ori pe săptămâna, cu scopul de a urmări apariţia efectului citopatic, cu un grosisment între 40 x la 150 x. Dacă efectul citopatic este evident, se începe imediat procedura de identificare a virusului în conformitate cu partea I cap. IV.

Articolul 14Subcultivarea

a)Dacă nu se produce nici un efect citopatic în prima incubaţie de 7-10 zile, se procedează la o subcultivare pe culturi celulare proaspete, utilizându-se o suprafaţa celulara similară cu cea din cultura primara.

b)Cantitatea de mediu - lichid supernatant - care provine din toate culturile/godeurile ce constituie cultura primara este adunata într-un pool pentru fiecare linie celulara, la 7-10 zile după inoculare. Esantioanele - pool-urile - sunt apoi inoculate pe culturi celulare omoloage, nediluat şi diluat 1/10, rezultând în final dilutii ale supernatantului de 1:10 şi 1:100, astfel cum este descris în art. 11. Părţi de 10% din mediul ce constituie cultura primara sunt inoculate direct într-un godeu cu culturi celulare proaspete, subcultivare godeu la godeu. Inocularea poate fi precedată de o preincubare a dilutiilor cu antiser contra virusului NPI în dilutii corespunzătoare, în conformitate cu cap. II art. 9. c) Incubarea următoare, timp de 7-10 zile la 15°C, se face în conformitate cu art. 12. d) Dacă se produce un efect citopatic toxic în primele 3 zile de incubaţie, se poate realiza o subcultivare în acest stadiu, dar celulele trebuie să fie incubate 7 zile, urmată de o subcultivare cu durata de incubaţie tot de 7 zile. Atunci când se produce un efect citopatic toxic după 3 zile, celulele pot fi pasate o dată şi incubate pentru a obţine un total de 14 zile de la prima inoculare. Nu trebuie să existe semne de toxicitate în cursul ultimelor 7 zile de incubaţie.

e)Dacă se produce o contaminare bacteriana în ciuda tratamentului cu antibiotice, subcultivarea trebuie precedată de o centrifugare la 2.000-4.000 x g timp de 15-30 de minute, la temperatura de 2-5°C, şi/sau de o filtrare a supernatantului cu un filtru - membrana cu procent scăzut de absorbţie a proteinei - de 0,45 æm. În plus faţă de acest aspect, procedurile de subcultivare sunt aceleaşi ca şi cele care se aplică în cazul apariţiei efectului citopatic toxic.

Capitolul 4Identificarea virusului

Articolul 15Teste de identificare virala

Dacă se observa apariţia de efect citopatic în culturile celulare, mediul de cultura - supernatantul - este colectat şi examinat prin una dintre următoarele tehnici: neutralizare, imunofluorescenta, ELISA.

Dacă prin aceste teste nu se definitiveaza identificarea virusului într-o săptămâna, supernatantul trebuie să fie trimis la un laborator naţional de referinţa sau la laboratorul de referinţa al Uniunii Europene pentru bolile pestilor, în vederea identificarii imediate.

Articolul 16Neutralizarea

a)Se indeparteaza celulele din supernatantul colectat, prin centrifugare la 2.000-4.000 x g sau filtrare prin membrana de 0,45 æm cu procent scăzut de absorbţie a proteinelor, şi se dilueaza supernatantul 1:100 şi 1:10.000 în mediu de culturi celulare.

b)Părţi din cele doua dilutii ale supernatantului sunt amestecate separat şi incubate pentru 60 de minute la 15°C cu părţi egale din următorii reagenti:

1.ser ce conţine anticorpi anti virusul SHV la dilutie 1:50, vol:vol;

2.ser ce conţine anticorpi anti virusul IHN la dilutie 1:50, vol:vol;

3.pool de antiser anti serotipurile indigene la virusul IPN la dilutie 1:50, vol:vol;

4.doar mediu - martor pozitiv.

c)50 æl din fiecare amestec format din supernatantul cu virusul de identificat şi ser se inoculeaza pe cel puţin două culturi celulare şi se incubeaza la 15°C. Se urmăreşte apariţia efectului citopatic asa cum este descris în art. 13. d) Unele tulpini de virus SHV nu reactioneaza la testele de neutralizare. Astfel de izolate trebuie să fie identificate prin imunofluorescenta - IF - sau ELISA.

e)Pot fi utilizate alternativ şi alte teste de neutralizare cu eficienta dovedită.

Articolul 17Imunofluorescenta - IF

a)Pentru fiecare izolat viral care trebuie să fie identificat este necesar să se cultive cel puţin 8 lamele sau echivalentul, cu celule la o densitate care să asigure o confluenta de aproximativ 60-90% după 24 ore de la cultivare. Linia celulara EPC este recomandată pentru acest scop datorită aderentei sale puternice la suprafeţele de sticlă, dar pot fi folosite, de asemenea, şi alte linii celulare cum sunt BF2, RTG2 sau FHM.

b)Virusul care trebuie să fie identificat se inoculeaza când celulele s-au prins pe suprafaţa de sticlă, la aproximativ o ora după tripsinizare, sau când culturile au fost incubate până la 24 ore. Patru culturi sunt inoculate la un raport volum la volum de 1:10 şi patru culturi la un raport de 1:1.000. Acestea sunt apoi incubate la 15°C pentru 20-30 de ore.

c)După incubaţie, culturile sunt clatite de doua ori în mediu Eagle's MEM fără ser fetal, se fixează în 80% acetona rece şi se coloreaza apoi prin tehnica de imunofluorescenta indirecta - IFAT. Primul strat de reagent este reprezentat de anticorpi monoclonali sau policlonali la o calitate de referinţa. Al doilea strat de reagent este reprezentat de un antiser - antiimunoglobulinele utilizate în primul strat -, conjugat cu fluorocrom. Pentru fiecare dintre antiserurile testate se utilizează cel puţin o cultura inoculata cu doza crescută şi o cultura inoculata cu doza scăzută. Este necesară includerea în test a martorilor pozitivi şi negativi. Este recomandată folosirea fluorocromilor fluorescein izotiocianat - FITC - sau tetrametil-rodamin-izotiocianat - TRITC.

d)Lamelele cu culturi celulare tratate cu reagentii de mai sus se monteaza în glicerol salin. Se examinează la microscop cu sursa de lumina ultravioleta - UV. Se utilizează oculare de 10 x sau 12 x şi obiective de x 25 sau x 40 cu apertura mai mare de 0,7 şi, respectiv, de 1,3. e) Tehnica de IF descrisă mai sus este un exemplu. Pot fi aplicate şi alte tehnici de IF a căror eficacitate a fost dovedită: culturi celulare, fixare şi anticorpi de referinţa.

Articolul 18Elisa

a)Godeurile din placa de microtitrare sunt captusite peste noapte cu dilutii stabilite de fracţiuni de imunoglobuline purificate provenite din seruri de referinţa.

b)După spalarea godeurilor cu tampon fosfat salin - PBS-Tween 20, virusul care trebuie identificat este pipetat în godeuri în trepte de dilutie din 2 în 2 sau din 4 în 4 şi se lasă sa reactioneze cu anticorpii ce captusesc placa, timp de 60 de minute la 37°C. După spalare cu tampon PBS-Tween 20, sunt adaugati anticorpii a căror specificitate corespunde cu cea a anticorpilor ce captusesc godeurile şi se lasă sa reactioneze 60 de minute la 20°C. După o alta spalare ca mai sus se adauga streptavidin conjugat cu peroxidaza din hrean - HRP - şi se lasă sa reactioneze pentru o ora la 20°C. După ultima spalare, enzima legată este vizualizata folosindu-se un substrat ELISA corespunzător.

c)Reactia ELISA de mai sus cu biotina-avidina este un exemplu. Pot fi folosite şi alte tipuri de ELISA cu eficienta dovedită.Partea a II-a Procedurile de diagnostic pentru confirmarea SHV şi NHI în episoadele de boala

Articolul 19

Una sau mai multe dintre următoarele tehnici trebuie să fie efectuate pentru diagnosticul SHV şi NHI:

A. izolare virala cu identificare serologica ulterioară;

B. izolare virala cu identificare serologica simultană;

C. alte tehnici de diagnostic (IFAT, ELISA).

Articolul 20

Confirmarea pentru prima data a SHV sau NHI în ferme din zone agreate nu trebuie efectuată numai prin metoda C. Trebuie folosită, de asemenea, ori metoda A ori B.

Articolul 21

Probele de organe destinate examenului virusologic trebuie să fie însoţite în anumite cazuri de material suplimentar în vederea efectuării examenelor bacteriologic, parazitologic, histologic sau a altor examene necesare diagnosticului diferential.

A. Izolare virala cu identificare serologica ulterioară

1.a) Selecţia probelor: cel puţin 10 peşti ce prezintă semne tipice de NHI sau SHV trebuie să fie selectaţi pentru examinare.

b)Pregătirea şi expedierea probelor de peste: astfel cum este prevăzut în partea I cap. I art. 5. c) Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic: astfel cum este prevăzut în partea I cap. I art. 6.

2.Prepararea probelor în vederea examinării virusologice: astfel cum este prevăzut în partea I cap. II.

3.Examinarea virusologica: astfel cum este prevăzut în partea I cap. III.

4.Identificarea virusului: astfel cum este prevăzut în partea I cap. IV.

B. Izolare virala cu identificare serologica simultană

1.a) Selecţia probelor: asa cum este prevăzut la lit. A pct. 1 lit. a).

b)Pregătirea şi expedierea probelor de peste: astfel cum este prevăzut în partea I cap. I art. 5. c) Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic: astfel cum este prevăzut în partea I cap. I art. 6.

2.a) Omogenizarea organelor: astfel cum este prevăzut în partea I cap. II art. 8.

b)Centrifugarea omogenatului: omogenatul este centrifugat într-o centrifuga cu răcire la 2-5°C, la 2.000-4.000 x g, timp de 15 minute, iar supernatantul este colectat şi tratat pentru 4 ore la 15°C cu antibiotice, de exemplu gentamicina 1mg/ml, sau filtrat prin membrana de 0,45 æm, cu procent scăzut de legare a proteinei.

c)Tratarea supernatantului cu antiser: suspensia de organe tratata cu antibiotice sau filtrata este diluata 1:10 şi 1:1000 în mediu de culturi celulare, iar părţi din acesta se amesteca şi se incubeaza 60 de minute la 15°C cu părţi egale din reagentii menţionaţi în partea I cap. IV art. 16.

3.a) Culturile celulare şi mediile de cultura: astfel cum sunt prevăzute în partea I cap. III art. 10;

b)Inocularea culturilor de celule: cel puţin două linii celulare sunt inoculate cu 50 æl din fiecare amestec virus-ser (preparat astfel cum este prevăzut la pct. 2 de mai sus).

c)Incubarea culturilor celulare: astfel cum este prevăzută în partea I cap. III art. 12. d) Microscopie

–culturile celulare inoculate sunt controlate zilnic la microscop, pentru verificarea apariţiei efectului citopatic, la o marire de la 40 x la 150 x. Dacă efectul citopatic este împiedicat să apară de unul din antiserurile folosite, virusul poate fi considerat a fi identificat corespunzător;

–dacă nici unul dintre antiserurile folosite nu împiedica apariţia efectului citopatic, se procedează la identificarea virusului în conformitate cu cele prezentate în partea I cap. IV.

e)Subcultivarea: dacă nu se produce nici un efect citopatic în 7-10 zile, se procedează la o subcultivare plecand de la culturi inoculate cu lichid supernatant şi mediu în conformitate cu lit. B pct. 2 c) şi partea I cap. III art. 14.

C. Alte tehnici de diagnostic

1.Lichidul supernatant preparat astfel cum este indicat în partea I cap. II art. 9 poate fi supus unor tehnici de IFAT sau ELISA, în conformitate cu partea I cap. IV art. 17-18.

2.Aceste tehnici rapide trebuie să fie completate printr-un examen virusologic în 48 de ore după prelevare, în conformitate cu lit. A sau B, dacă:

a)a fost obţinut un rezultat negativ;

sau

b)a fost obţinut un rezultat negativ de la o prelevare reprezentând primul caz de NHI sau SHV într-o zona agreată.

3.Materialul tisular poate fi supus şi altor tehnici de diagnostic cum ar fi RT-PCR, IF pe secţiuni congelate sau imunohistochimie pe material tisular fixat în formol.

4.Aceste tehnici trebuie să fie întotdeauna însoţite de inoculare pe culturi celulare de material tisular nefixat.

Partea a III-aDemonstrarea absentei anterioare de SHV şi/sau NHI în zone sau ferme din zone neagreate

Articolul 22Linii directoare şi criterii care se aplică unui program de inspecţii sanitare veterinare oficiale

(1)Un program de inspecţii sanitare veterinare poate fi pus în aplicare doar în următoarele situaţii:

a)după un program de eradicare a SHV şi/sau NHI recunoscut oficial, care să cuprindă eliminarea tuturor pestilor din unitate, curăţenie mecanică, dezinfecţie şi lăsarea pe uscat înainte de repopularea cu peşti din unităţi agreate;

sau

b)în unităţi piscicole în care nu a evoluat anterior nici o infectie legată de virusul SHV sau NHI.

(2)Programul de inspecţii sanitare veterinare oficiale trebuie să se bazeze pe examinari clinice şi examene de laborator.

(3)Programul trebuie să cuprindă doua inspecţii sanitare veterinare clinice anuale, în conformitate cu cele indicate în partea I. (4) Cel puţin la una dintre inspecţiile anuale, la fiecare dintre unităţi se preleveaza 30 de probe de tesut de peste şi/sau lichid ovarian. Probele sunt selectate, prelucrate şi supuse unui examen de laborator în conformitate cu cele prevăzute în partea I cap. II şi IV.

(5)Programul de inspecţii sanitare veterinare trebuie să fie aplicat pentru cel puţin 4 ani în toate unităţile din zona sau într-o unitate dintr-o zona neagreata, destinată să fie agreată.

(6)Pentru ca un program să fie recunoscut oficial, nu trebuie să se producă sau să fie detectat nici un caz de SHV sau NHI, nici ca infectie clinica, nici în urma unei izolari virale.Partea a IV-a Titrarea destinată verificării sensibilităţii culturilor celulare la infectie

Articolul 23

Procedurile recomandate pentru titrarea la care se face referire în partea I cap. III art. 12 sunt prezentate în continuare.

Articolul 24

Este necesar să se utilizeze cel puţin două tulpini de virus SHV şi o tulpina de virus NHI. Tulpinile trebuie să fie reprezentative pentru principalele tulpini virale din Uniunea Europeană, de exemplu, în ceea ce priveşte virusul SHV, o tulpina patogena provenind de la pastravul curcubeu din apa dulce şi o tulpina patogena din mediul marin pentru calcan, iar în ceea ce priveşte virusul NHI, o tulpina patogena pentru pastravul curcubeu provenind din Europa. Este necesar să se utilizeze tulpini virale bine definite provenind din statele membre ale Uniunii Europene.

Articolul 25

Tulpinile de referinţa sunt disponibile în laboratoarele de referinţa ale Uniunii Europene pentru bolile pestilor.

Articolul 26

Loturile de virus având un număr redus de pasaje pe culturi celulare sunt cultivate în flacoane de culturi celulare pe liniile BF2 sau RTG2 pentru virusul SHV şi pe linia celulara EPC pentru virusul NHI. Trebuie să se utilizeze un mediu de cultura la care să se adauge cel puţin 10% ser fetal. Este necesar să se utilizeze un indicator MOI, iar raportul dintre numărul de particule virale infectioase ce se adauga la un număr cunoscut de celule dintr-o cultura să fie sub 1.

Articolul 27

Atunci când efectul citopatic este total, virusul din supernatant este colectat prin centrifugarea culturilor celulare la 2000 x g pentru 15 minute, sterilizat prin filtrare printr-un filtru de membrana de 0,45 æm şi distribuit în criotuburi notate. Virusul este păstrat la o temperatura de -80°C.

Articolul 28

La o săptămâna după inghetare 3 criotuburi cu câte o tulpina virala fiecare sunt dezghetate în apa rece şi titrate pe liniile celulare sensibile. Cel puţin la fiecare 6 luni, sau dacă susceptibilitatea liniilor celulare se banuieste ca a scăzut, fiecare tulpina virala este dezghetata şi titrata.

Articolul 29

Procedura de titrare trebuie să fie descrisă în detaliu pentru ca aceeaşi procedura să fie urmată de fiecare data.

Articolul 30

Titrarea prin dilutie limita trebuie să cuprindă cel puţin 6 replicari de fiecare serie de dilutie. Titrurile sunt comparate cu titrurile obţinute anterior. Dacă titrul uneia dintre cele 3 tulpini virale scade cu un factor de 2 log sau mai mult, în raport cu titrul iniţial, linia celulara nu mai trebuie să fie utilizata în scop de supraveghere.

Articolul 31

Dacă liniile celulare sunt conservate în laborator, fiecare linie trebuie să fie examinata separat.

Articolul 32

Registrele cu evidentele de laborator trebuie să fie păstrate cel puţin 10 ani.

Partea a V-aAcronime şi abrevieri

BF2 Bluegill fry (linie celulara)

ECP Efect citopatic

CRL Laborator de referinţa al Comunităţii Europene pentru

bolile pestilor

ELISA Test imunoenzimatic

EPC Epithelioma papulosum cyprini (linie celulara)

FHM Fathead minnow (linie celulara)

FITC Fluorescein izotiocianat

Hepes Acid N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etan sulfonic

HRP Peroxidaza din hrean

IF Imunofluorescenta

IFAT Test de imunofluorescenta indirecta

NHI Necroza hematopoietica infectioasa

NPI Necroza pancreatica infectioasa

MEM Mediu minim esenţial

MOI Multiplicity of infection (raportul dintre numărul de

particule virale infectioase adăugate la un număr cunoscut

de celule din cultura)

OPD Ortho phenilen diamine

PBS Tampon fosfat salin

RTG2 Rainbow trout gonad (linie celulara)

RT-PCR Reversed transcriptase polymerase chain reaction

Tris-HCI Tris-hidroximetil-aminometan-HCI

TRITC Tetrametil-rodamin-izotiocianat

SHV Septicemia hemoragica virala

Articolul 33

Anexele nr. 1, 2 şi 3 fac parte integrantă din prezenta norma sanitară veterinara.

Anexa 1

la norma sanitară veterinara

Tabelul 1 A

Schema de inspecţie şi recoltare pentru zonele şi fermele

din zonele neagreate pentru o perioadă de control

de doi ani care preceda obţinerea statutului

de agreare pentru SHV şi/sau NHI

Număr maxim de peşti/pool: 10.

*1) O proba cu număr redus de peşti, conform tabelului 1B, se poate

recolta dacă sunt îndeplinite prevederile descrise în textul părţii

a II-a şi a III-a din prezenta norma sanitară veterinara.

*2) Inspecţii clinice.

*3) În circumstanţe excepţionale, dacă este imposibil să se obţină lichid

ovarian, se vor recolta organe.

*4) Probele nu trebuie să fie colectate mai devreme de 3 săptămâni după

transferul pestilor din apa dulce în apa marina.

Anexa 2

la norma sanitară veterinara

Tabelul 1 B

Schema de inspecţie şi recoltare pentru o perioadă de control

de doi ani care preceda obţinerea statutului de agreare

pentru SHV şi/sau NHI în zone şi ferme din zone neagreate,

pentru care absenta anterioară a bolilor

a fost oficial dovedită

Număr maxim de peşti/pool: 10.

*1) Inspecţii clinice.

*2) În situaţii excepţionale, dacă este imposibil să se obţină lichid

ovarian, se pot recolta organe.

*3) Probele nu trebuie să fie recoltate mai devreme de 3 săptămâni după

transferul pestilor din apa dulce în apa marina.

Anexa 3

la norma sanitară veterinara

Tabelul 1 C

Schema de inspecţie şi recoltare pentru zonele şi fermele din zone

neagreate în scopul menţinerii statutului de agreare pentru

SHV şi/sau NHI

Număr maxim de peşti/pool: 10.

*1) În zonele agreate probele trebuie să fie recoltate doar prin rotaţie

la 50% din ferme în fiecare an. În fermele agreate din zonele

neagreate trebuie să fie recoltate în fiecare an.

*2) În situaţii excepţionale, dacă este imposibil să se obţină lichid

ovarian, se pot recolta organe.

*3) Probele nu trebuie să fie recoltate mai devreme de 3 săptămâni după

transferul pestilor din apa dulce în apa marina.