Ordin nr. 387 din 21 mai 2007

În temeiul prevederilor art. 5 din Ordonanţa Guvernului nr. 136/2000 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, cu modificările şi completările ulterioare,

în temeiul Hotărârii Guvernului nr. 385/2007 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale,

văzând Referatul de aprobare nr. 292.399 din 18 mai 2007 al Agenţiei Naţionale Fitosanitare din cadrul Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale,

ministrul agriculturii şi dezvoltării rurale emite prezentul ordin.

Articolul I

Ordinul ministrului agriculturii, pădurilor şi dezvoltării rurale nr. 912/2004 privind controlul putregaiului inelar al cartofului, produs de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 127 şi 127 bis din 9 februarie 2005, se modifică şi se completează după cum urmează:

1.Anexele nr. I-IV se modifică şi se înlocuiesc cu anexele nr. I-IV*) care fac parte integrantă din prezentul ordin.

2.După anexa nr. IV se introduce o nouă anexă, anexa nr. V*), care face parte integrantă din prezentul ordin.

Notă *) Anexele se publică ulterior în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 417 bis în afara abonamentului, care se poate achiziţiona de la Centrul pentru relaţii cu publicul al Regiei Autonome "Monitorul Oficial", Bucureşti, şos. Panduri nr. 1.

Articolul II

Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Articolul III

Prezentul ordin transpune prevederile Directivei Consiliului 2006/56/CEE din 12 iunie 2006, care amendează anexele Directivei Consiliului 93/85/CEE privind controlul putregaiului inelar al cartofului.

Ministrul agriculturii

şi dezvoltării rurale,

Decebal Traian Remeş

Bucureşti, 21 mai 2007.

Nr. 387.

Anexa I

PROTOCOL

de testare în vederea diagnosticării, detectării şi identificării agentului responsabil de putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann şi Kotthoff) Davis et al.

DOMENIU DE APLICARE AL PROTOCOLULUI DE TESTARE

Protocolul prezentat în continuare descrie diferitele etape ce trebuie urmate pentru:

(i)diagnosticarea putregaiului inelar al cartofului în tuberculi şi plante de cartof;

(îi) detectarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de tuberculi

şi plante de cartof;

(iii)identificarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus

PRINCIPII GENERALE

Protocoalele optimizate pentru diversele metode, reactivii validaţi şi modalităţile de preparare a materialului necesar pentru teste şi pentru controale figurează în apendicii din prezenta anexă. În apendicele 1 din prezenta anexă se furnizează o listă a laboratoarelor incluse pentru optimizarea şi validarea protocoalelor.

Deoarece protocoalele implică detectarea unui organism dăunător de carantină şi includ utilizarea culturilor viabile de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus ca materiale de control, este necesar ca procedurile să se desfăşoare în condiţii adecvate de carantină, cu instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor şi cu respectarea cerinţelor referitoare la licenţele corespunzătoare emise de autorităţile oficiale responsabile pentru carantină.

Parametrii testelor trebuie să garanteze o detectare coerentă şi reproductibilă a nivelurilor de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus la pragurile stabilite pentru metodele selecţionate.

Este necesară pregătirea exactă a martorilor pozitivi.

Realizarea testelor în funcţie de pragurile cerute implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecţi, întreţinerea şi calibrarea echipamentelor, manevrarea şi conservarea atentă a reactivilor şi toate măsurile care vizează împiedicarea contaminării între probe, de exemplu, separarea martorilor pozitivi de probele de testat. Trebuie aplicate norme de control al calităţii pentru a evita apariţia oricărei greşeli, în special de ordin administrativ, în etichetare şi în documentaţie.

Apariţia suspectată a unui focar, conform art. 4 alin. (2), implică o reacţie pozitivă la testele de diagnostic sau de depistare efectuate pe o probă, după cum se indică în diagrame.

În cazul în care primul test de depistare [testul de imunofluorescenţă (IF) sau testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)/testul de hibridizare fluorescentă în situ (FISH)] este pozitiv, există o suspiciune de contaminare cu Clavibacter michiganensis. ssp. sepedonicus şi trebuie efectuat un al doilea test de depistare. În cazul în care şi al doilea test de depistare este pozitiv, suspiciunea este confirmată (apariţie suspectată) şi testele trebuie continuate în conformitate cu protocolul. În cazul în care al doilea test de depistare este negativ, proba este considerată necontaminată cu Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Reacţia pozitivă la testul IF, prevăzută la art. 4 alin. (2) din ordin, este aşadar definită ca o reacţie pozitivă la testul IF, confirmată de un al doilea test de depistare (PCR/FISH).

Prezenţa confirmată, prevăzută la art. 5 alin. (1) din ordin, implică izolarea şi identificarea unei culturi pure de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, cu confirmarea patogenităţii.

1.PREZENTAREA DIAGRAMEI FUNCŢIONALE

1.1.Protocol de detectare în vederea diagnosticării putregaiului inelar al cartofului în tuberculi şi plante de cartof care prezintă simptome ale bolii (vezi diagrama 1)

Procedura de testare vizează tuberculii şi plantele de cartof care prezintă simptome caracteristice veştejirii bacteriene sau care prezintă suspiciunea prezenţei bolii respective. Procedura prevede un test rapid de depistare, izolarea organismului patogen plecând de la ţesutul vascular infectat pe medii de diagnostic şi, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

DIAGRAMA 1

!Imagine

1) Descrierea simptomelor figurează la pct. 2.

2) Testele adecvate sunt:

–testul IF (pct. 4);

–testul PCR (pct. 6);

–testul FISH (pct 5).

3) Deşi izolarea prin diluţie şi însămânţare pe medii de cultură a agentului patogen provenit din materialul vegetal care prezintă simptome caracteristice este o sarcină simplă, însămânţarea pe mediul de cultură poate să dea rezultate eronate în stadiile avansate de infecţie. Bacteriile saprofite care se dezvoltă pe un ţesut bolnav pot să se multiplice mult mai repede decât agentul patogen sau să îi inhibe creşterea pe mediul de izolare. Aşadar, se recomandă să se utilizeze în acelaşi timp medii neselective şi selective, de preferinţă de tip MTNA (pct. 8) sau să se recurgă la testul biologic (pct. 7).

4) Profilul morfologic al unei colonii caracteristice este prezentat la pct. 8.

5) Atunci când testul de izolare este negativ, în ciuda existenţei simptomelor caracteristice ale bolii, trebuie repetată izolarea.

6) Se poate identifica în mod sigur o cultură pură de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, utilizând testele enumerate la pct. 9.

7) Testul de patogenitate este descris la pct. 10.

1.2.1.Protocol de detectare şi de identificare a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de tuberculi de cartof fără simptome (vezi diagrama 2)

Principiu

Procedura de testare vizează detectarea infecţiilor latente ale tuberculilor de cartof. Orice rezultat pozitiv la cel puţin două teste de depistare, bazate pe principii biologice diferite, trebuie completat cu izolarea organismului patogen, urmată, în caz de izolare a coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Rezultatul pozitiv al unui singur test de depistare nu este suficient pentru ca proba să fie considerată suspectă.

Testele de depistare şi testele de izolare trebuie să permită praguri de detectare cuprinse între 10^3 şi 10^4 celule/mL în depozitul resuspendat, inclusiv în martorii pozitivi din fiecare serie de teste.

DIAGRAMA 2

!Imagine

1) Dimensiunea probei standard este de 200 de tuberculi, deşi procedura poate fi aplicată şi unor probe mai mici, în cazul în care nu se dispune de 200 de tuberculi.

2) Extracţia organismului patogen şi metodele de concentrare sunt descrise la pct. 3.1.

3) În cazul în care cel puţin două teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie să se efectueze izolarea şi confirmarea. Se va realiza cel puţin un test de depistare. În cazul în care testul respectiv este negativ, proba se consideră negativă. În cazul în care testul este pozitiv, trebuie să se efectueze cel puţin un al doilea test de depistare, bazat pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau următoarele sunt negative, proba este considerată negativă. În acest caz nu este necesară efectuarea altor teste.

4) Testul IF

Se utilizează întotdeauna un anticorp policlonal pentru testele IF. Se poate obţine o specificitate mai mare (vezi pct. 4), asociind anticorpului menţionat anticorpi monoclonali suplimentari.

5) Testul PCR.

Se utilizează reactivi şi protocoale PCR validate în mod corespunzător (vezi pct. 6).

6) Testul FISH.

Se utilizează reactivi şi protocoale validate (vezi pct. 5).

7) Izolare selectivă

Asociată cu utilizarea unui mediu MTNA sau NCP-88 şi a unei diluări la 1/100 din sediment resuspendat, izolarea selectivă constituie, în numeroase cazuri, o metodă bună de izolare directă a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Coloniile caracteristice se pot obţine într-o perioadă de 3 până la 10 zile de la însămânţare. Atunci este posibil să se efectueze purificarea şi identificarea agentului patogen. Pentru a profita din plin de posibilităţile oferite de testul în cauză, trebuie să se pregătească cu grijă conurile de cartof prelevate de la nivelul hilului pentru a evita contaminarea cu bacterii secundare legate de tubercul, care constituie organisme concurente ale bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe mediul de cultură şi sunt susceptibile de a înlocui agentul patogen menţionat. În cazul obţinerii unui rezultat eronat la testul de însămânţare, izolarea trebuie efectuată din plantele utilizate pentru testul biologic (vezi pct. 8).

8) Testul biologic este utilizat pentru izolarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus din extractele de cartof, prin îmbogăţire selectivă în plante de vinete (Solanum melongena). Sunt necesare condiţii optime de incubare, în conformitate cu specificaţiile procedurii în cauză. Bacteriile care au efect inhibitor asupra bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus în prezenţa unui mediu MTNA sau NCP-88 nu riscă să afecteze desfăşurarea testului menţionat (vezi pct. 7).

9) Profilul morfologic al unei colonii caracteristice este prezentat la pct 8.

10) Însămânţarea pe mediul de cultură sau testele biologice pot fi eronate din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care testele de depistare dau rezultate pozitive, dar testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare din acelaşi sediment sau cu ajutorul unor noi ţesuturi vasculare prelevate din apropierea hilului de pe tuberculi tăiaţi provenind din aceeaşi probă şi, după caz, trebuie testate probe suplimentare.

11) Se pot identifica în mod sigur culturi pure de izolaţi presupuşi de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, utilizând testele enumerate la pct. 9.

12) Testul patogenităţii este descris la pct. 10.

1.3.Protocol de detectare şi de identificare a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de plante de cartof fără simptome (vezi diagrama 3)

DIAGRAMA 3

!Imagine

1) Vezi pct. 3.2 pentru dimensiunea recomandată a probelor.

2) Extracţia organismului patogen şi metodele de concentrare sunt descrise la pct. 3.2.

3) În cazul în care cel puţin două teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea şi confirmarea. Se realizează cel puţin un test de depistare. În cazul în care testul respectiv este negativ, proba se consideră negativă. În cazul în care testul este pozitiv, trebuie să se efectueze cel puţin un al doilea test de depistare, bazat pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau următoarele sunt negative, proba este considerată negativă. În acest caz nu este necesară efectuarea altor teste.

4) Testul de izolare selectivă şi profilul morfologic al unei colonii caracteristice sunt prezentate la pct. 8.

5) Testul IF este descris la pct 4.

6) Testele PCR sunt descrise la pct. 6.

7) Testul FISH este descris la pct. 5.

8) Testul biologic este descris la pct. 7.

9) Izolarea pe mediu de cultură sau testele biologice pot fi eronate din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care testele de depistare dau rezultate pozitive, dar testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare şi, dacă este cazul, trebuie testate probe suplimentare.

10) Se pot identifica în mod sigur culturi pure de izolaţi presupuşi de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, utilizându-se testele enumerate la pct. 9.

11) Testul de patogenitate este descris la pct. 10.

2.EXAMINAREA VIZUALĂ A SIMPTOMELOR PUTREGAIULUI INELAR AL CARTOFULUI

2.1.Plante de cartof

În contextul climatic european se întâmplă rareori ca simptomele să fie observate pe teren, iar atunci când este cazul, acest lucru se întâmplă numai la sfârşitul sezonului. Adesea simptomele pot fi mascate de cele ale altor boli, de vătămări mecanice sau îmbătrânire ori pot fi confundate cu acestea. Aşadar, simptomele pot trece cu uşurinţă neobservate în momentul inspecţiei pe teren. Simptomele veştejirii sunt foarte diferite de cele ce caracterizează putregaiul inelar al cartofului. În general, primul simptom progresează într-adevăr lent şi se limitează iniţial la marginea frunzelor. În cazul celui de-al doilea, frunzele tinere infectate continuă să crească, într-o manieră mai puţin obişnuită, ceea ce dă frunzelor un aspect neregulat. Frunzele plantelor atinse de obstrucţia ţesuturilor vasculare situate mai jos pe tulpină prezintă adesea între nervuri pete clorotice de culoare galbenă sau portocalie. Se întâmplă ca frunzuliţele, frunzele şi chiar tulpinile infectate să moară. Deseori, frunzele şi tuberculii se micşorează. Ocazional se constată o atrofiere a plantelor. Ilustraţii colorate ale unor simptome se pot găsi la adresa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2.2.Tuberculi de cartof

Primele simptome apar mai ales în apropierea hilului şi dau un aspect uşor sticlos sau translucid ţesutului, fără înmuiere în jurul sistemului vascular. Inelul vascular poate prezenta, la nivelul hilului, o culoare mai închisă decât de obicei. Primul simptom, uşor de identificat, este o îngălbenire a inelului vascular, ceea ce conduce la eliminarea din vase a unui exudat cu aspect cremos la presarea uşoară a tuberculului. Exudatul respectiv conţine milioane de bacterii. Poate apărea o brunificare a ţesutului vascular şi în acest stadiu simptomele tuberculului sunt asemănătoare cu cele ale veştejirii bacteriene produse de bacteria Ralstonia solanacearum. Într-o primă fază, simptomele pot să se limiteze la o porţiune a inelului care nu este neapărat situată în apropierea hilului, dar ulterior aceste simptome vor cuprinde treptat întreg inelul. Pe măsură ce infecţia progresează, ţesuturile vasculare sunt distruse, iar cortexul exterior se poate separa de cortexul interior. În stadiile avansate ale infecţiei, la suprafaţa tuberculului apar fisuri cu marginile adesea colorate în roşu brun. În multe cazuri observate recent în Europa se constată o putrezire simultană a cortexului central şi a inelului vascular, care antrenează o infecţie secundară cu apariţia de cavitaţi interne şi necroză. O infecţie fungică sau bacteriană secundară poate masca simptomele şi poate fi dificil şi chiar imposibil să se distingă simptomele avansate ale putregaiului inelar al cartofului de simptomele altor putregaiuri ale tuberculilor. Nu trebuie excluse nici formele fără simptome. Ilustraţii colorate ale unor simptome se pot găsi la adresa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

3.PREPARAREA PROBEI

3.1.Tuberculi de cartof

a)se acoperă conurile cu un volum suficient de tampon de extracţie (aproximativ 40 mL; vezi apendicele 3) şi se aşază pe un agitator rotativ (50 şi 100 ture/minut) timp de 4 ore, la o temperatură mai mică de 24°C, sau timp de 16-24 de ore, în cazul în care sunt refrigeraţi; sau b) se omogenizează conurile cu o cantitate suficientă de tampon de extracţie (aproximativ 40 mL; vezi apendicele 3) fie într-un mixer (de exemplu, Waring sau Ultra Thurax), fie zdrobindu-le cu un ciocan din cauciuc sau cu un alt dispozitiv de zdrobire potrivit (de exemplu, Homex), într-o pungă de macerare de unică folosinţă, sigilată (de exemplu, de tip Stomacher sau "Bioreba strong guage polythene" de 150 mm x 250 mm, sterilizată cu radiaţii ionizante).

a)se acoperă fragmentele de tulpină cu un volum suficient de tampon de extracţie (aproximativ 40 mL; vezi apendicele 3) şi se aşază pe un agitator rotativ (între 50 şi 100 ture/minut) timp de 4 ore, la o temperatură mai mică de 24°C, sau timp de 16-24 de ore, în cazul în care sunt refrigerate; sau b) fragmentele se zdrobesc imediat într-o pungă de macerare rezistentă (de exemplu, Stomacher sau Bioreba), cu o cantitate adecvată de tampon de extracţie (vezi apendicele 3), folosindu-se un ciocan de cauciuc sau un alt dispozitiv de zdrobire corespunzător (de exemplu, Homex). În caz contrar, fragmentele trebuie să fie păstrate la frigider maximum 72 de ore sau la temperatura mediului ambiant maximum 24 de ore.

3.2.3.După o sedimentare de 15 minute, se decantează supernatantul.

3.2.4.De obicei, nu este necesar să se efectueze o nouă limpezire a extractului sau a concentraţiei fracţiunii bacteriene; cu toate acestea, limpezirea se poate efectua prin filtrare şi/sau centrifugare, în conformitate cu metoda descrisă la pct. 3.1.4-3.1.6.

3.2.5.Se separă extractul de probă pur/concentrat în două părţi egale. Una dintre părţi se păstrează pe toată durata testului la o temperatură de 4-10°C, iar cealaltă se depozitează la o temperatură cuprinsă între -16 şi -24°C (săptămâni) sau între -68 şi -86°C (luni), după ce s-a adăugat în prealabil o cantitate de glicerol steril 10-25% (în volum), pentru cazurile în care va fi necesară efectuarea unor testări suplimentare.

4.TESTUL DE IMUNOFLUORESCENŢĂ (IF)

Principiu

Ţinându-se seama de capacitatea sa recunoscută de a atinge cerinţele solicitate, se recomandă utilizarea testului IF ca principal test de depistare.

În cazul în care testul IF este utilizat ca principal test de depistare şi rezultatul său este unul pozitiv, trebuie să se efectueze un test PCR sau FISH ca test secundar. În cazul în care testul IF este folosit ca test secundar, iar rezultatul său este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, în conformitate cu indicaţiile din diagrama funcţională.

!Imagine

Figura 2. Prepararea lamei de testare în conformitate cu pct. 4.1 (ii) şi 4.3 (ii)

!Imagine

4.3.1.Se plasează lamele pe hârtie umedă. Se acoperă complet fiecare godeu cu una sau mai multe diluţii de anticorpi. Cantitatea de anticorpi aplicată pe fiecare godeu trebuie să fie cel puţin egală cu volumul de extract aplicat.

În absenţa instrucţiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi, se aplică următoarea procedură:

4.3.2.Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite timp de 30 de minute, la temperatura mediului ambiant (18-25°C).

4.3.3.Se elimină picăturile de pe fiecare lamă şi se clăteşte cu grijă cu tampon IF. Se spală 1prin imersie timp de 5 minute într-o soluţie tampon IF-Tween (vezi apendicele 3), apoi încă 5 minute într-o soluţie tampon IF. Se evită orice vaporizare sau vărsare care ar putea determina o contaminare încrucişată. Se elimină cu atenţie excesul de umiditate cu ajutorul hârtiei sugative.

4.3.4.Se plasează lamele pe hârtie umedă. Se acoperă godeurile cu conjugat FITC la diluţia utilizată la titrare. Cantitatea de conjugat aplicată pe godeuri trebuie să fie identică cu cantitatea de anticorpi utilizată.

4.3.5.Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite timp de 30 de minute, la temperatura mediului ambiant (18-25°C).

4.3.6.Se elimină de pe lamă picăturile de conjugat. Se clăteşte şi se spală în conformitate cu indicaţiile anterioare (vezi pct. 4.3.3).

Se elimină cu grijă excesul de umiditate.

4.3.7.În fiecare godeu se pipetează 5-10 æL tampon glicerol-fosfat 0,1 M (vezi apendicele 3) sau un suport antidecolorare din comerţ, apoi se acoperă cu o lamelă.

4.4.Citirea testului IF:

4.4.1.Se examinează lamele-test cu ajutorul unui microscop cu epifluorescenţă prevăzut cu filtre adaptate la excitaţia FITC-ului, în imersie cu ulei sau apă şi cu o mărire de la 500 la 1.000. Se examinează godeurile pe două diametre perpendiculare şi în jurul perimetrului. Pentru probele care nu prezintă celule sau care prezintă doar un număr redus de celule se observă cel puţin 40 de câmpuri microscopice.

Se începe prin a se controla lama martorului pozitiv. Celulele trebuie să prezinte o fluorescenţă vie şi să fie complet colorate la titrul de anticorp sau de diluţie de lucru determinat. În cazul unei colorări anormale, testul IF (vezi pct. 4) trebuie repetat.

4.4.2.Se caută în godeurile lamelor-test prezenţa celulelor cu o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (vezi site-ul web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenţei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii martor pozitiv pentru o diluţie identică de anticorpi. Celulele a căror colorare este incompletă sau care prezintă o fluorescenţă slabă nu trebuie luate în considerare.

La cea mai mică suspiciune de contaminare testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla în cazul în care toate lamele dintr-un lot prezintă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sunt izolate şi găsite în exteriorul godeurilor.

4.4.3.Există un anumit număr de probleme inerente specificităţii testului de imunofluorescenţă. La nivelul conurilor de ţesut vascular şi în segmentele de tulpină de cartof pot apărea populaţii de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic, precum şi bacterii saprofite care pot da reacţii încrucişate având mărime şi morfologie asemănătoare cu Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

4.4.4.Numai celulele fluorescente care au o dimensiune şi o morfologie caracteristice titrului sau diluţiei de lucru a anticorpilor menţionaţi la pct. 4.3 trebuie să fie luate în considerare.

4.4.5.Interpretarea testului IF:

(i)Dacă proba conţine celule care prezintă o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică, se evaluează numărul mediu de celule caracteristice per câmp microscopic şi se calculează numărul celulelor menţionate per mL de sediment resuspendat (vezi apendicele 4).

Testul IF este considerat pozitiv atunci când proba conţine cel puţin 5 x 10^3 celule caracteristice per mL de sediment resuspendat. În acest caz, proba este considerată ca fiind potenţial contaminată şi trebuie să se continue testele.

(îi) Testul IF este considerat negativ atunci când proba conţine mai puţin de 5 x 10^3 celule per mL de sediment resuspendat, iar proba este considerată necontaminată.

Nu este necesară continuarea testelor.

5.TESTUL DE HIBRIDIZARE FLUORESCENTĂ IN SITU (FISH)

Principiu

Dacă testul FISH este folosit ca test de depistare iniţial şi rezultatul său este pozitiv, trebuie să se efectueze un test IF ca al doilea test obligatoriu de depistare. În cazul în care testul FISH este folosit ca test secundar, iar rezultatul său este pozitiv, diagnosticul trebuie completat de teste suplimentare, aşa cum este indicat în diagramă.

9.2.Testul de imunofluorescenţă (IF)

a)Se prepară o suspensie de aproximativ 10^6 celule per mL într-un tampon IF (vezi apendicele 3).

b)Se prepară o diluţie la jumătate dintr-un antiser corespunzător.

c)Se urmează procedura testului IF (vezi pct. 4).

d)Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obţinut din cultură trebuie să fie echivalent cu cel obţinut din martorul pozitiv.

9.3.Testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)

a)Se prepară o suspensie de aproximativ 10^6 celule per mL în apă ultrapură.

b)Într-un bloc de încălzire sau într-o baie de apă fiartă se încălzesc 100 æl de suspensie în tuburi închise, la temperatura de 100°C timp de 4 minute. Dacă este necesar, se adaugă NaOH proaspăt preparat, cu o concentraţie finală de 0,05 M pentru a facilita liza celulelor. Probele pot fi depozitate la temperaturi cuprinse între -16°C şi -24°C, până în momentul utilizării.

c)Se aplică procedurile PCR corespunzătoare pentru a amplifica ampliconii specifici de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (de exemplu: Pastrik, 2000; vezi apendicele 4; Li şi de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik şi Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

d)Identificarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus este pozitivă atunci când ampliconii PCR au aceeaşi dimensiune şi prezintă aceleaşi polimorfisme de lungime ale fragmentelor de restricţie ca şi pentru tulpina-martor pozitivă.

9.4.Testul de hibridizare fluorescentă în situ (FISH)

a)Se prepară o suspensie de aproximativ 10^6 celule per mL în apă ultrapură.

b)Se urmează procedura testului FISH (vezi pct. 5).

c)Testul FISH este pozitiv în cazul în care se obţin aceleaşi reacţii din cultură ca şi la martorul pozitiv.

9.5.Testul de profil al acizilor graşi (FAP)

a)Cultura se dezvoltă timp de 72 de ore la temperatura de 21°C (+/-1°C) pe tripticaza soia agar (Oxoid).

b)Se aplică o procedură FAP corespunzătoare (Janse, 1991; Stead, 1992).

c)Pentru ca un test FAP să fie pozitiv, profilul culturii presupuse trebuie să fie identic cu cel al martorului pozitiv. Prezenţa acizilor graşi caracteristici 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 şi 17:0 Anteiso este puternic elocventă pentru bacteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Alte genuri de bacterii, ca de exemplu Curtobacterium, Arthrobacter şi Micrococcus, prezintă, de asemenea, unii dintre acizii menţionaţi, dar foarte rar 15:1 Anteiso A; în schimb, acidul menţionat este prezent la toate bacteriile Clavibacter spp., la niveluri cuprinse între 1% şi 5%. Pentru Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, nivelul menţionat este de obicei în jurul valorii de 5%.

9.6.Testul BOX-PCR

a)Se prepară o suspensie de aproximativ 10^6 celule per mL în apă ultrapură.

b)Se efectuează testul conform procedurii (Smith et al., 2001).

10.TESTUL DE CONFIRMARE

Testul de patogenitate se efectuează atât pentru a aduce confirmarea finală a unui diagnostic de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, cât şi pentru a evalua virulenţa culturilor identificate ca fiind Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

10.1.Se prepară un inoculum de aproximativ 10^6 celule/mL dintr-o cultură de 3 zile a izolatului de testat şi dintr-o tulpină-martor pozitivă, corespunzătoare bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

10.2.Se inoculează 5-10 tulpini de plante tinere de vinete în stadiul celei de-a treia frunze adevărate (vezi pct. 7.3 sau 7.4).

10.3.Se incubează la temperaturi cuprinse între 18°C şi 24°C, la o umiditate relativ ridicată, asigurând o stropire corespunzătoare pentru a preveni obturarea hidrică sau stresul cauzat de secetă (vezi pct. 7.7). În cazul culturilor pure ar trebui să apară o veştejire tipică în două săptămâni; cu toate acestea, plantele care nu prezintă simptome (vezi pct. 7.8) la sfârşitul acestei perioade trebuie lăsate în continuare la incubat până la 3 săptămâni, la temperaturi favorabile creşterii vinetelor, nedepăşind temperatura de 25°C (vezi apendicele 8). Dacă la sfârşitul celor 3 săptămâni nu apar simptome, cultura nu poate fi confirmată ca fiind o formă patogenă de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

10.4.Se izolează din plante cu simptome, prelevându-se o secţiune de tulpină la o înălţime de 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se mărunţesc şi se suspendă într-o cantitate mică de apă distilată sterilă sau de tampon fosfat 50 mM (vezi apendicele 3). Se izolează din suspensie, diluând prin însămânţare simplă sau în striuri pe MTNA şi YPGA (vezi apendicele 5), se incubează timp de 3-5 zile la o temperatură cuprinsă între 21°C şi 23°C, apoi se observă formarea coloniilor caracteristice de C. m. ssp. sepedonicus.

Apendice 1

Laboratoare care practică optimizarea şi validarea protocoalelor

*1) Pentru experţii de contact vezi site-ul web la adresa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Apendice 2

Prepararea martorilor pozitivi şi negativi pentru testele de depistare PCR/IF şi FISH aplicate tuberculilor de cartof

Se însămânţează pe un mediu MTNA, timp de 72 de ore, o tulpina virulentă de C. m. ssp. sepedonicus îNCPPB 4053 sau PD 406ş, apoi se suspendă în tampon fosfatat 10 mM, astfel încât să se obţină o densitate celulară de aproximativ 1-2 x 10^8 UFC per mL. Aceasta corespunde, în general, unei suspensii uşor tulburi, care prezintă o densitate optică de 0,20-600 nm.

Se prelevează conurile de la 200 de tuberculi dintr-o recoltă de cartof alb, cunoscută ca fiind lipsită de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Se tratează conurile urmând metoda obişnuită şi se resuspendă sedimentul în 10 mL.

Se pipetează 900 æL de sediment resuspendat în 10 microtuburi sterile de 1,5 mL.

Se însămânţează primul microtub cu 100 æL din suspensia de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Se omogenizează prin vortexare.

Se stabilesc niveluri de contaminare la a zecea parte, urmând diluţii în următoarele 5 microtuburi.

Cele 6 microtuburi contaminate vor fi utilizate ca martori pozitivi. Cele 4 microtuburi necontaminate vor fi utilizate ca martori negativi. Microtuburile se etichetează corespunzător.

Se prepară alicoţi de 100 æL în microtuburi sterile de 1,5 mL, astfel încât să se obţină 9 repetiţii ale fiecărei probe-martor. Se depozitează la temperaturi cuprinse între -16 şi -24°C până în momentul utilizării.

Prezenţa şi determinarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus în probele-martor trebuie confirmate în primul rând printr-un test IF.

Pentru testul PCR se extrage ADN pe baza probelor-martor pozitive şi negative din fiecare serie de probe.

Pentru testele IF şi FISH, se efectuează analize pe probele-martor pozitive şi negative ale fiecărei serii de probe.

În cazul testelor IF, FISH şi PCR, Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus trebuie detectat în martorii pozitivi cel puţin 10^6 şi 10^4 celule/mL şi trebuie să lipsească complet în martorii negativi.

Apendice 3

Tampoane pentru procedurile de testare

Generalitate: tampoanele sterilizate care nu sunt deschise pot fi depozitate timp de maximum un an.

1.TAMPOANE PENTRU PROCEDURA DE EXTRAGERE

1.1.Tampon de extracţie (tampon fosfat 50 mM, pH 7,0)

Tamponul menţionat este utilizat pentru extracţia, prin omogenizare sau agitare, a bacteriei prezente în ţesuturile plantei.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C.

Următoarele componente pot fi utile:

Notă *) A se utiliza cu metoda de extracţie prin omogenizare.

1.2.Tampon de sedimentare (tampon fosfat 10 mM, pH 7,2)

Tamponul menţionat este utilizat pentru resuspendarea şi diluţia sedimentelor de conuri de cartof concentrate prin centrifugare.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C.

2.TAMPOANE PENTRU TESTUL IF

2.1.Tampon IF (tampon fosfat salin PBS 10 mM, pH 7,2)

Tamponul menţionat este utilizat pentru diluţia anticorpilor.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C.

2.2.Tampon IF-Tween

Tamponul menţionat este utilizat pentru spălarea lamelor.

Se adaugă 0,1% Tween 20 la tamponul IF.

2.3.Tampon Glicerol fosfat, pH 7,6

Tamponul menţionat este utilizat ca lichid de montare pentru lamele IF, pentru a întări fluorescenţa.

Soluţii suport antidecolorare sunt disponibile în comerţ: exemplu, Vectashield(^R) (Vector Laboratories) sau Citifluor (^R) (Leica).

Apendice 4

Determinarea gradului de contaminare în momentul testelor IF şi FISH

1.Se numără numărul mediu de celule fluorescente caracteristice per câmp (c).

2.Se calculează celulele fluorescente caracteristice per godeu (C).

C = c x S/s,

unde:

S = suprafaţa (S) godeului unei lame cu multe godeuri; şi

s = suprafaţa câmpului obiectivului

3.Se calculează celulele fluorescente caracteristice per mL de sediment resuspendat (N)

N = C x 1.000/y x F,

unde: y = volumul de sediment resuspendat din fiecare godeu

F = factorul de diluţie al sedimentului resuspendat; şi

C = celule fluorescente caracteristice per godeu

Apendice 5

Medii de izolare şi de cultură ale bacteriei C. m. ssp. sepedonicus

(a) Medii de cultură generale

(b) Medii de creştere selective validate

Se dizolvă ingredientele şi se ajustează pH-ul la 7,2. După autoclavare (15 minute la 121°C) şi o răcire la 50°C se adaugă antibioticele: trimetoprim 0,06 g, acid nalidixic 0,002 g, amfotericină B 0,01 g.

Soluţiile stoc de antibiotice sunt: trimetoprimul (Sigma) şi acidul nalidixic (Sigma) (ambele 5 mg/mL) în metanol 96%; amfotericina B (Sigma) (1 mg/mL) în dimetilsulfoxid. Soluţiile stoc sunt sterilizate prin filtrare.

Se dizolvă ingredientele şi se ajustează pH-ul la 7,2. Se sterilizează prin autoclavare şi se răceşte la 50°C, se adaugă apoi următoarele antibiotice: sulfat de polimixină B (Sigma) 0,003 g, acid nalidixic (Sigma) 0,008 g, cicloheximidă (Sigma) 0,2 g.

Antibioticele se dizolvă în soluţiile stoc, după cum urmează: acidul nalidixic în NaOH 0,01 M; cicloheximida în etanol 50%, sulfatul de polimixină B în apă distilată. Soluţiile stoc sunt sterilizate prin filtrare.

Dimensiunea prevăzută a ampliconului de ADN de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus = 502 bp (în prezenţa primerului PSA).

Dimensiunea prevăzută a ampliconului controlului PCR intern 18S rRNA = 377 bp (în prezenţa primerului NS).

1.2.Mixul pentru PCR

1) Metodele au fost validate utilizând Taq polimeraza de la Perkin Elmer (AmpliTaq sau Gold) şi Gibco BRL.

2) Concentraţiile primerilor NS-7-F şi NS-8-R au fost optimizate pentru extracţia ADN-ului din tuberculii de cartof, utilizând metoda omogenizării şi a purificării ADN-ului după Pastrik (2000); vezi pct. 6.1. (a) şi 6.2ş. Va fi necesară o nouă optimizare a concentraţiilor de reactivi dacă se utilizează extracţia prin agitare sau alte metode de extracţie a ADN-ului.

1.3.Condiţii ale reacţiei PCR

Se execută următorul program:

2.2.Tampon de încărcare

3.10X TAMPON TRISACETAT EDTA (TAE), pH 8,0

Apendice 7

Reactivi validaţi pentru testul FISH

1.Oligosonde

2.SOLUŢIE DE FIXARE

ATENŢIE! SOLUŢIA DE FIXARE CONŢINE PARAFORMALDEHIDĂ, CARE ESTE TOXICĂ. SE MANIPULEAZĂ CU MĂNUŞI ŞI NU SE INHALEAZĂ. SE RECOMANDĂ SĂ SE LUCREZE SUB O NIŞĂ CHIMICĂ.

(i)Se încălzesc 9 mL de apă pură moleculară (de exemplu, apă ultrapură) la aproximativ 60°C şi se adaugă 0,4 g de paraformaldehidă. Paraformaldehida se dizolvă după ce s-au adăugat 5 picături de 1N NaOH şi se amestecă pe un agitator magnetic.

(îi) Se ajustează pH-ul la 7,0 adăugându-se 1 mL de tampon fosfatat 0,1 M (PB; pH 7,0) şi 5 picături de 1N HCl. Se verifică pH-ul cu hârtie indicator şi se ajustează, în cazul în care este necesar, cu HCl sau NaOH.

ATENŢIE! NU SE UTILIZEAZĂ PH-METRU ÎN SOLUŢII CARE CONŢIN PARAFORMALDEHIDĂ.

(iii)Soluţia se filtrează printr-un filtru cu membrană de 0,22 æm, se protejează de praf şi se păstrează la 4°C până la utilizare.

(iv)NOTĂ:

Soluţie de fixare alternativă: etanol 96%.

3.HIBMIX 3X

4.Soluţie de hibridizare

Se prepară cantităţile de soluţie de hibridizare, respectând calculele din tabel. Pentru fiecare lamă (care conţine două probe diferite în duplicat) sunt necesari 90 æL de soluţie de hibridizare.

Tabel: Cantităţi sugerate pentru prepararea amestecului de hibridizare

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C.

Apendice 8

Culturi de vinete

Se seamănă seminţe de vinete (Solanum melongena) într-un pământ sterilizat prin pasteurizare. Atunci când cotiledoanele sunt complet dezvoltate (10-14 zile), plantulele se repică într-un pământ sterilizat prin pasteurizare.

Vinetele trebuie cultivate în seră în următoarele condiţii:

Furnizor: vezi site-ul web la adresa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Apendice 9

Procedura pentru reacţia Gram (modificarea lui Hucker) (Doetsch, 1981)

Soluţie Cristal violet

Se dizolvă 2 g cristal violet în 20 mL etanol 95%.

Se dizolvă 0,8 g oxalat de amoniu în 80 mL apă distilată.

Se amestecă cele două soluţii.

Soluţia iod Lugol

Substanţele solide se zdrobesc împreună cu ajutorul unui pistil şi al unui mojar. Se adaugă apă şi se amestecă într-un recipient închis pentru a se dizolva.

Soluţie colorantă de safranină

Soluţie stoc:

Se amestecă şi se depozitează.

Se diluează în raport 1:10 pentru a obţine o soluţie de lucru.

Procedura de colorare

1.Se prepară frotiurile, se usucă la aer şi se fixează la căldură.

2.Se scufundă lama în soluţia de cristal violet timp de un minut.

3.Se spală rapid cu apă curentă .

4.Se scufundă în soluţia iod Lugol timp de un minut.

5.Se spală cu apă de robinet şi se usucă cu hârtia sugativă.

6.Se decolorează adăugând picătură cu picătură etanol 95%, până când nu îşi mai modifică culoarea, sau scufundând în etanol timp de 30 de secunde şi agitând uşor.

7.Se spală cu apă de robinet şi se usucă cu hârtia sugativă.

8.Se scufundă în soluţia de safranină timp de 10 secunde.

9.Se spală cu apă de robinet şi se usucă cu hârtia sugativă.

Bacteriile Gram pozitive au o culoare violet-albastră; bacteriile Gram negative au o culoare roz-roşie.

Anexa II

1.Pentru fiecare apariţie suspectată pentru care s-a identificat un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform metodelor descrise în anexa nr. I şi confirmată sau infirmată prin aplicarea completă a metodelor menţionate trebuie să se păstreze şi să se conserve adecvat:

–toţi tuberculii prelevaţi şi, de câte ori este posibil, toate plantele prelevate;

–orice extract rămas şi materialul pregătit suplimentar pentru testul/testele de depistare, de exemplu lamele de imunofluorescenţă; şi

–toată documentaţia relevantă, până la finalizarea metodei menţionate.

Păstrarea tuberculilor permite testarea soiului, efectuată atunci când este cazul.

2.În cazul confirmării organismului, trebuie să se păstreze şi să se conserve în condiţii corespunzătoare:

–materialul specificat la alin. (1); şi

–o mostră din materialul de vânătă infectată, inoculată cu un tubercul sau extract de plantă; şi

–cultura izolată a organismului,

timp de minimum o lună de la procedura de notificare conformă art. 5 alin. (2).

Anexa III

1.Elementele avute în vedere pentru determinarea gradului contaminării probabile conform art. 5 alin. (1) lit. b) includ:

–tuberculii sau plantele cultivate într-un loc de producţie declarate ca fiind contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. a);

–locul/locurile de producţie care au o anumită legătură cu producerea tuberculilor sau plantelor declarate ca fiind contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. a), inclusiv acelea care utilizează echipamente şi utilaje de producţie în mod direct sau printr-un contractor comun;

–tuberculii sau plantele produse în locul/locurile de producţie menţionat(e) la liniuţa anterioară sau prezente în asemenea loc/locuri de producţie, în perioada în care tuberculii sau plantele declarate ca fiind contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. a) au fost prezente în locurile de producţie menţionate la prima liniuţă;

–locurile unde sunt manipulaţi cartofii care provin din locurile de producţie menţionate la liniuţele anterioare;

–orice utilaj, vehicul, container, depozit sau părţi din acestea şi oricare alte obiecte, inclusiv ambalajul, care au venit în contact cu tuberculii sau plantele declarate ca fiind contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. a);

–orice tuberculi sau plante depozitate în sau în contact cu oricare dintre elementele ori obiectele menţionate la liniuţa anterioară, înainte de curăţarea şi dezinfectarea acestora;

–acei tuberculi care, ca rezultat al testelor menţionate la art. 7, au o legătură clonală cu tuberculii sau plantele declarate ca fiind contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. a) şi care, deşi rezultatele testelor referitoare la prezenţa organismului au fost negative, sunt consideraţi probabil contaminaţi prin intermediul unei legături clonale. Testarea soiului poate fi efectuată pentru a verifica identitatea tuberculilor sau a plantelor contaminate şi legătura clonală; şi

–locul/locurile de producţie a tuberculilor sau a plantelor menţionate la liniuţa anterioară.

2.Elementele avute în vedere pentru determinarea unei posibile răspândiri conform art. 5 alin. (1) lit. c) includ:

–apropierea de alte locuri de producţie unde se cultivă cartofi sau alte plante-gazdă;

–producţia şi utilizarea comună a stocurilor de cartof de sămânţă.

3.Notificarea menţionată la art. 5 alin. (2) lit. b) cuprinde:

a)imediat după confirmarea prezenţei organismului prin teste de laborator, efectuate conform metodelor descrise în anexa nr. I, cel puţin:

–denumirea soiului lotului de cartofi;

–tipul (consum, sămânţă etc.) şi, dacă este cazul, categoria de cartofi de sămânţă;

b)atunci când există un risc de contaminare a cartofilor proveniţi dintr-unul sau mai multe state membre ori care au ca destinaţie unul sau mai multe state membre, statul membru în care a fost confirmată apariţia organismului comunică imediat statului membru sau statelor membre în cauză informaţiile necesare conform art. 6, cum ar fi:

–denumirea soiului lotului de cartof;

–numele şi adresa expeditorului şi destinatarului;

–data livrării lotului de cartof;

–mărimea lotului de cartof livrat;

–atunci când este cazul, o copie a paşaportului fitosanitar sau cel puţin numărul paşaportului fitosanitar, precum şi numărul de înregistrare al producătorului sau al comerciantului şi o copie a bonului de livrare. Comisiei i se notifică imediat aceste informaţii;

c)după finalizarea tuturor investigaţiilor, pentru fiecare caz:

–data la care s-a confirmat contaminarea;

–o scurtă descriere a investigaţiilor realizate pentru identificarea sursei şi posibilei răspândiri a contaminării, precizând intensitatea prelevării;

–informaţii privind sursa/sursele identificate sau presupuse a/ale contaminării;

–detalii ale întinderii contaminării declarate, inclusiv numărul de locuri de producţie şi numărul de loturi, cu indicarea soiului şi, în cazul cartofului de sămânţă, a categoriei;

–detalii ale zonei delimitate, inclusiv numărul de locuri de producţie nedeclarate ca fiind contaminate, dar incluse în zonă;

–toate celelalte informaţii pe care Comisia le solicită, referitoare la focarul sau focarele confirmate.

Anexa IV

1.Măsurile luate sub control oficial, conform art. 8 alin. (1), sunt:

–utilizarea în hrana animalelor după un tratament termic, astfel încât să nu existe niciun risc de supravieţuire a organismului; sau

–eliminarea într-un loc autorizat de distrugere a deşeurilor în mod oficial, în care nu există niciun risc identificabil de propagare a organismului în mediu, de exemplu, prin infiltrare în terenuri agricole; sau

–incinerarea; sau

–transformarea industrială prin livrare directă şi imediată la o fabrică de procesare a plantelor care dispune de instalaţii de eliminare a deşeurilor, autorizate oficial, despre care s-a stabilit că nu prezintă niciun risc identificabil de răspândire a organismului, precum şi de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc fabrica; sau

–alte măsuri, în situaţia în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului; aceste măsuri şi justificarea lor trebuie să fie notificate Comisiei şi celorlalte state membre.

Toate deşeurile asociate şi care rezultă din operaţiile menţionate anterior sunt eliminate prin metode aprobate oficial, în conformitate cu anexa nr. V la prezentul ordin.

2.Utilizarea sau eliminarea corespunzătoare a tuberculilor ori a plantelor declarate ca fiind probabil contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. b) şi menţionate la art. 8 alin. (2), sub controlul organismelor oficiale responsabile ale statelor membre în cauză, prin comunicări corespunzătoare între organismele oficiale responsabile pentru a asigura controlul permanent şi aprobarea de către organismele oficiale responsabile ale statului membru în care cartofii urmează să fie ambalaţi sau procesaţi, cu privire la instalaţiile de eliminare a deşeurilor menţionate la prima şi a doua liniuţă, includ:

–utilizarea acestora drept cartofi destinaţi consumului, în ambalaje prevăzute pentru livrare şi utilizare directă care nu necesită reambalare, într-un loc care dispune de instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor. Cartofii destinaţi plantării pot fi manipulaţi în acelaşi loc numai dacă sunt manipulaţi separat sau după curăţarea şi dezinfectarea acestuia; sau

–utilizarea acestora drept cartofi de consum destinaţi prelucrării industriale după livrarea directă şi imediată la o fabrică de prelucrare care dispune de instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor, precum şi de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc fabrica; sau

–un alt mod de utilizare sau eliminare, în măsura în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului şi a fost supus aprobării de către organismele oficiale responsabile.

3.Metodele corespunzătoare de curăţare şi de dezinfectare a obiectelor menţionate la art. 8 alin. (3) sunt cele prin care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului şi sunt aplicate sub control oficial.

4.Măsurile care trebuie puse în aplicare în zona delimitată, stabilită conform art. 5 alin. (1) lit. c), menţionate la art. 8 alin. (4) includ:

4.1.în locurile de producţie declarate ca fiind contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. a):

a)pe un teren declarat contaminat conform art. 5 alin. (1) lit. a):

(i)pe durata a minimum 3 ani care urmează anului contaminării declarate:

–se iau măsuri de eliminare a plantelor de cartof spontane şi a celorlalte plante-gazdă spontane ale organismului; şi

–nu se plantează şi nu se seamană niciun tubercul, plantă sau sămânţă de cartof, nicio altă plantă-gazdă spontană a organismului sau nicio cultură pentru care există un risc identificabil de răspândire a organismului;

–în primul sezon de cultivare a cartofilor, care urmează după perioada specificată la liniuţa anterioară şi cu condiţia ca terenul să fi fost găsit liber de plante spontane de cartof şi de alte plante-gazde spontane ale organismului, în timpul inspecţiilor oficiale, timp de minimum doi ani consecutivi înainte de plantare, va fi autorizată numai producţia de cartofi de consum şi tuberculii recoltaţi trebuie să fie testaţi conform procedurii descrise în anexa nr. I;

–în sezonul de cultură a cartofilor, care urmează celui menţionat la liniuţa anterioară şi după un ciclu adecvat de rotaţie, care trebuie să fie de minimum 2 ani, se autorizează plantarea cartofilor de sămânţă pentru producţia de cartofi de sămânţă sau de consum şi se efectuează supravegheri oficiale, conform art. 2 alin. (1); sau

(îi) pe durata a 4 ani de cultură care urmează anului contaminării declarate:

–se iau măsuri de eliminare a plantelor spontane de cartof şi a celorlalte plante-gazde ale organismului prezente spontan; şi

–terenul trebuie să fie lăsat şi menţinut fie necultivat, fie ca păşune permanentă şi, în acest caz, este frecvent cosit scurt sau folosit la păşunat intensiv;

–în primul sezon de cultivare a cartofilor, care urmează după perioada specificată la liniuţa anterioară şi cu condiţia ca terenul să fi fost găsit liber de plante spontane de cartof şi de alte plante-gazde spontane ale organismului, în timpul inspecţiilor oficiale, timp de minimum 2 ani consecutivi înainte de plantare, se va autoriza producţia de cartofi de sămânţă sau de consum şi tuberculii recoltaţi vor fi testaţi conform procedurii descrise în anexa nr. I;

b)în toate celelalte terenuri din locul de producţie contaminat şi cu condiţia ca organismele oficiale responsabile să dobândească certitudinea că riscul reprezentat de plantele spontane de cartof şi de alte plante-gazdă spontane ale organismului a fost eliminat:

–în timpul anului de cultură care urmează anului contaminării declarate fie nu se plantează şi nu se seamănă niciun tubercul, plantă sau sămânţă de cartof sau nicio altă plantă- gazdă spontană a organismului; sau

–sămânţa de cartof certificată poate fi plantată numai pentru producţia de cartofi de consum;

–în timpul celui de-al doilea an de cultură care urmează anului contaminării declarate, numai sămânţa certificată sau cartofii de sămânţă testaţi oficial pentru absenţa putregaiului inelar şi cultivaţi sub control oficial în locurile de producţie, altele decât cele menţionate la pct. 4.1, vor fi plantaţi pentru producţia de cartofi de sămânţă sau de consum;

–cel puţin în timpul celui de-al treilea an de cultură care urmează anului contaminării declarate, numai cartofii de sămânţă certificaţi sau cartofii de sămânţă cultivaţi sub control oficial din cartofi de sămânţă certificaţi vor fi plantaţi pentru producţia de cartofi de sămânţă sau de consum;

–în timpul fiecăruia dintre anii de cultură menţionaţi la liniuţele anterioare se iau măsuri de eliminare a plantelor spontane de cartof, precum şi a altor plante-gazdă spontane ale organismului şi în fiecare câmp cu cartofi se efectuează teste oficiale asupra cartofilor recoltaţi, conform procedurii descrise în anexa nr. I;

c)imediat după declararea contaminării conform art. 5 alin. (1) lit. a) şi după primul an de cultură care urmează, toate utilajele şi toate instalaţiile de depozitare de la locul de producţie implicate în producţia de cartofi vor fi curăţate şi dezinfectate corespunzător, folosind metode corespunzătoare, specificate la pct. 3;

d)într-o unitate de producţie în cultură protejată unde este posibilă înlocuirea completă a mediului de cultură:

–nu se plantează şi nu se seamănă niciun tubercul, nicio plantă sau sămânţă, decât în cazul în care unitatea de producţie a fost supusă sub control oficial unor măsuri de eliminare a organismului şi de îndepărtare a tuturor plantelor-gazdă, inclusiv, cel puţin, înlocuirea completă a mediului de cultură, precum şi curăţarea şi dezinfectarea unităţii de producţie şi a tuturor echipamentelor, şi în cazul în care unităţile fitosanitare au autorizat ulterior unitatea pentru producţia de cartofi; şi

–producţia de cartofi va fi obţinută din cartofi de sămânţă certificaţi sau din minituberculi ori microplante provenite din surse testate;

4.2.în interiorul zonei delimitate şi fără a prejudicia măsurile enumerate la pct. 4.1 se aplică următoarele măsuri:

a)imediat după declararea contaminării toate maşinile şi instalaţiile de depozitare situate în astfel de locuri de producţie trebuie să fie curăţate şi dezinfectate corespunzător, în conformitate cu metodele corespunzătoare menţionate la pct. 3;

b)imediat după declararea contaminării şi timp de cel puţin 3 sezoane de cultură:

–se asigură supravegherea de către unităţile fitosanitare a spaţiilor în care se cultivă, depozitează sau se manipulează tuberculi de cartofi, precum şi a spaţiilor în care, pe bază de contract, funcţionează echipamente destinate producţiei de cartofi;

–se impune ca în zona respectivă să fie plantată doar sămânţă certificată sau sămânţă cultivată sub control oficial, pentru toate culturile de cartofi, şi testarea cartofilor de sămânţă recoltaţi din locurile de producţie declarate ca fiind probabil contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. b);

–se impune, pentru toate spaţiile din cadrul zonei, manipularea separată a stocurilor din recolta de cartofi de sămânţă faţă de cele destinate consumului sau punerea în aplicare a unui sistem de curăţare şi dezinfectare între manipularea stocurilor de cartofi de sămânţă şi a celor de consum;

–se efectuează inspecţii oficiale, conform art. 2 alin. (1);

c)se stabileşte, atunci când este cazul, un program de înlocuire a tuturor stocurilor de cartofi de sămânţă în decursul unei perioade corespunzătoare.Anexa V

Pentru a preveni orice risc identificabil de răspândire a organismului, metodele de eliminare a deşeurilor, aprobate în mod oficial şi prevăzute în anexa nr. IV pct 1, respectă următoarele dispoziţii:

(i)deşeurile de cartof (inclusiv cartofii eliminaţi şi cojile) şi orice alt deşeu solid asociat cartofilor (inclusiv pământ, pietre şi alte resturi) vor fi eliminate:

–într-un loc autorizat de distrugere a deşeurilor, în care nu există niciun risc identificabil de propagare a organismului în mediul înconjurător, de exemplu, prin infiltrare în terenurile agricole. Deşeurile sunt transportate direct la locul respectiv, în condiţii de izolare care previn orice risc de pierdere; sau

–prin incinerare; sau

–prin alte măsuri, în situaţia în care s-a stabilit că măsurile respective nu prezintă niciun risc identificabil de răspândire a organismului. Măsurile stabilite vor fi notificate Comisiei şi celorlalte state-membre;

(îi) deşeurile lichide: înainte de eliminare, deşeurile lichide ce conţin particule solide în suspensie trebuie să fie supuse unui procedeu de filtrare sau de sedimentare pentru a le îndepărta. Aceste particule solide vor fi eliminate conform pct. (i).

Apoi, deşeurile lichide vor fi:

–complet încălzite la o temperatură de 60°C timp de cel puţin 30 de minute înainte de a fi eliminate; sau

–eliminate într-un alt mod, cu aprobare oficială şi sub control oficial, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil ca deşeurile să între în contact cu terenurile agricole.

Detaliile vor fi notificate Comisiei şi celorlalte state membre.

Diferitele proceduri descrise în prezenta anexă se aplică în egală măsură şi deşeurilor asociate cu manipularea, eliminarea şi tratarea loturilor contaminate.